浙产三叶青的质量控制研究

余乐，刘敏，陈张金，王伟影 * (丽水市食品药品与质量技术检验检测院，浙江 丽水 323000)

摘要：目的 探讨制定浙产三叶青质量控制的方法和限度。方法 运用显微鉴别法、化学反应鉴别法进行鉴别，采用 UV

分别对活性成分(总黄酮、总多糖、总氨基酸)进行测定；参照中国药典 2015 年版四部相关方法对水分、总灰分、重金属

及有害元素和醇溶性浸出物进行测定。结果 浙产三叶青的化学反应、显微特征明显；12 批样品的测定结果表明，总黄

酮、总多糖和总氨基酸的含量分别为 0.18%~0.66%，21.59%~61.76%，0.93%~3.68%；水分、总灰分和醇溶性浸出物分别

为 7.6%~14.3%，2.2%~5.7%和 12.4%~22.6%；铅、镉、砷、汞、铜均未超过中国药典 2015 年版已收载品种重金属及有害

元素项下的限量标准。结论 研究所得方法简便、准确，可用于浙产三叶青的质量控制。

关键词：浙产三叶青；紫外分光光度法；重金属；有害元素；鉴别；质量控制

中图分类号：R284.1 文献标志码：B 文章编号：1007-7693(2018)08-1194-05

DOI: 10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2018.08.017

引用本文：余乐, 刘敏, 陈张金, 等. 浙产三叶青的质量控制研究[J]. 中国现代应用药学, 2018, 35(8): 1194-1198.

三叶青别名金线吊葫芦、丝线吊金钟、三叶扁藤、石老鼠、小扁藤、石猴子、土经丸、蛇附子、石抱子等，为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤( Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)的块根 [1] ，具有清热解毒、祛风止痛、活血化淤、利气化痰、健脾养胃等功效 [2] ，临床上常用于治疗高热惊厥、风湿酸痛、月经不调、咳喘脓痰、咽痛瘰疬、痈疔疮等症 [3] 。据研究报道，三叶青对肺炎、淋巴结结核、肝炎、胃炎、子宫颈炎、败血症等严重感染性疾病有明显疗效 [4-5] ；对多种恶性肿瘤和高血压、心脏病、糖尿病、神经衰弱等疾病均具有广泛而良好的治疗作用 [6-8] 。20 世纪 90 年代以来，中国学者从三叶青中分离得到了黄酮类化合物，经药理试验发现其具有抗肿瘤作用，引发了国内外学者的广泛关注。三叶青主要分布于我国浙江、广西、四川、贵州、云南等省区，随着三叶青在临床上的广泛应用，其野生资源面临短缺，为解决这一问题，目前已成功驯化扦插及组培等人工种植方法，浙江省为三叶青的主要种植产地之一。中国药典 2015年版未收载三叶青，《浙江省中药炮制规范》 [9] 2015 年版收载于根及根茎类中，但标准较为简单，仅有性状、粉末显微鉴别和浸出物。本课题组在研究中发现三叶青的产地不同，

其性状、有效成分会有较大差异，因此，本研究从鉴别(性状、显微、化学反应)、检查(水分、总灰分、重金属及有害元素)、浸出物、含量测定(UV)等多角度着手，首次研究浙产三叶青的质量评价体系，建立相关质量控制标准，以规范浙产三叶青的种植与应用。

1 仪器与试药

1.1 仪器

DM 2500 正置显微镜(奥林巴斯公司)；

UNE400 自然对流烘箱(德国 Memmert 有限公司)；

TU-1901 紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；

7900 电感耦合等离子体质谱仪(美国 Agilent 公司)；微波消解仪(CEM)。

1.2 试药

芦丁对照品(批号：100080-200707；含量：91.7%) 、 D - 无 水 葡 萄 糖 对 照 品 ( 批 号 ：110833-201516；含量：99.9%)购自中国药品生物制品检定所； L -门冬氨酸对照品(斯坦福分析化学公司，批号：LPA-894900；含量：100.0%)；砷(AS)、铅(Pb)、镉(Cd)、汞(Hg)、铜(Cu)元素标准溶液(标准编号分别为 GBW08611 16052、GBW0861916064、GBW08614 16074、GBW08617 16084、GBW08615 16103)均购自中国计量科学研究院；实验中所用试剂均为分析纯；水为娃哈哈纯净水。

1.3 药材

三叶青样品 12 批，均为丽水市种植基地提供，根据采集时间确定批号分别为 201504，201508，201509，201510，201511，201512，201601，201602，201603，201604，201605，201606，经丽水市食品药品与质量技术检验检测院李水福主任中药师鉴 定 为 葡 萄 科 崖 爬 藤 属 植 物 三 叶 崖 爬 藤( Tetrastigma hemsleyanum Diels et. Gilg)的块根。将以上 12 批药材洗净，切片，置 45 ℃鼓风干燥，供性状鉴别使用后分别粉碎，粉末过二号筛，备用。

2 药材鉴别

2.1 性状

鲜品呈纺锤形、卵圆形、葫芦形或椭圆形，较圆整，一般长 1.5~7.0 cm，直径 1.0~2.0 cm。表面棕褐色，多数较光滑，少数有皱纹和皮孔样小瘤状突起，或有凹陷，其内残留棕褐色细根；质

硬而脆，断面平坦粗糙，类白色，粉性，可见淡棕色形成层环，水浸液有明显的黏性；气微，味微甘。饮片类圆形或不规则的厚片，直径 0.7~1.5cm，表面棕褐色，切面类白色，质松脆，粉性，

气微，味微甘。

2.2 显微鉴别

2.2.1 方法 取适量药材粉末过 5 号筛后，按粉末制片法制作粉末水装片及水合氯醛透化后装片，置显微镜下观察。

2.2.2 结果 本品粉末类白色。淀粉粒极多，多单粒，椭圆形、类三角形、类圆形，直径 4~16 µm，脐点点状、短缝状、星状或人字状，复粒少见；黏液细胞类圆形或方形，直径 20~90µm，内含黏液质，有的含草酸钙针晶束；针晶成束或散在，长 30~60 µm；纤维呈金黄色，单个，多破碎，直径 20~70 µm；导管为具缘纹孔导管，直径30~90 µm。结果见图 1。

图 1 显微特征图

1淀粉粒；2 黏液细胞；3 草酸钙针晶束；4 纤维；5 具缘纹孔导管。

Fig. 1 Tetrastigmae pieces

1starch granules; 2 mucous cell; 3 raphides of calcium oxalate; 4 fibre;

5 marginal orifice catheter.

2.3 化学反应

2.3.1 盐酸-镁粉显色反应 [10]274 取本品 2 g，加75%乙醇 20 mL，超声处理 20 min，静置 15 min，过滤，取滤液 1 mL，加镁粉少许及稀盐酸 3~5 滴，水浴中放置 3~5 min，溶液显红色呈现正反应。2.3.2 α-萘酚-浓硫酸显色反应 [10]273 取本品粉末5 g，加水 10 mL，水浴中放置 30 min，滤过，取滤液 1 mL，加入 50% α-萘酚乙醇液 2~3 滴，摇匀，沿试管壁缓缓加入浓硫酸 1 mL，两液交界处显棕黄色呈现正反应。

2.4 检查

2.4.1 水分、总灰分、浸出物的测定 按中国药典 2015 版四部 [11]104,202,204 进行测定。结果见表 1。

2.4.2 重金属及有害元素的测定 按中国药典2015 版四部通则 [11]205 测定。结果见表 2。表 1 水分、总灰分、浸出物、含量测定结果(n=2)

Tab. 1 Results of moisture, total ash, extractive and

assaying(n=2) %

编号 水分 总灰分 浸出物 总黄酮 总多糖 氨基酸

201504 8.8 2.2 12.4 0.18 34.15 1.00

201508 7.8 3.6 14.9 0.31 47.45 1.39

201509 10.0 3.9 22.6 0.50 37.54 3.68

201510 8.8 4.5 21.0 0.44 44.87 1.15

201511 10.7 4.1 13.8 0.48 44.57 1.01

201512 7.6 3.9 16.9 0.47 39.22 1.25

201601 12.9 4.0 16.3 0.51 35.38 1.77

201602 9.2 3.5 17.5 0.53 61.76 1.86

201603 14.3 4.0 13.7 0.45 21.59 2.74

201604 10.9 5.7 22.2 0.66 31.98 1.88

201605 12.9 4.3 16.7 0.45 35.97 0.93

201606 12.6 3.9 19.9 0.52 38.12 1.75

表 2 重金属及有害元素测定结果

Tab. 2 Results of heavy metals and harmful elements

mg·kg 1

编号 As Hg Pb Cd Cu

201504 0.007 0.012 0.147 0.017 0.149

201508 0.002 0.002 0.254 0.022 0.405

201509 0.003 0.002 0.348 0.049 0.538

201510 0.006 <0.001 0.397 0.025 0.498

201511 0.003 <0.001 0.320 0.020 0.432

201512 0.006 <0.001 0.313 0.014 0.435

201601 0.006 <0.001 0.392 0.022 0.474

201602 0.003 <0.001 0.371 0.022 0.507

201603 0.014 <0.001 0.337 0.026 0.423

201604 0.014 <0.001 0.622 0.054 0.577

201605 0.006 <0.001 0.478 0.047 0.395

201606 0.006 <0.001 0.408 0.024 0.626

2.5 含量测定

2.5.1 总黄酮测定 [10]355

2.5.1.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品 22.28 mg，置 100 mL 量瓶中，用 50%的甲醇定容，摇匀，得到浓度为 0.204 3 mg·mL 1 的对照品溶液。

2.5.1.2 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液1，2，3，4，5，6 mL，分别置 25 mL 量瓶中，各加 50%甲醇至 6.0 mL，加 5%亚硝酸钠溶液1 mL．混匀，放置 6 min，再加 10%硝酸铝溶液

1 mL，摇匀，放置 6 min，加氢氧化钠试液 10 mL，再加 50%甲醇至刻度，摇匀，放置 15 min，以相应试剂为空白，按中国药典 2015 年版 UV 法，在500 nm 处测定吸光度，以浓度 C(mg·mL 1 )为横坐标，吸光度 A 为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为 A =0.012 52 C +0.002 32( r =0.999 9)，结果显示芦丁在 0.008 17~0.057 21 mg·mL 1 内有良好线性关系。

2.5.1.3 供试品溶液的制备 取本品粉末约 1 g，精密称定，加 50%的甲醇 25 mL，称定质量，加热回流 1 h，放冷，再称定质量，用 50%的甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

2.5.1.4 样品含量测定 精密量取供试品溶液3 mL，置 25 mL 量瓶中，加 50%甲醇至 6 mL，按“2.5.1.2”项下方法，自“加亚硝酸钠溶液 1 mL”起，依法测定吸光度，同时取供试品溶液 3 mL，除不加氢氧化钠试液外，其余同上操作，作为空白，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的含量，计算，即得。结果见表 1。

2.5.1.5 仪 器 精 密 度 试 验 取 浓 度 为0.024 52 mg·mL 1 的芦丁对照品溶液，按“2.5.1.2”项下方法显色，在 510 nm 处重复测定吸光度 6 次，RSD 为 0.75%( n=6)，结果表明仪器精密度良好。

2.5.1.6 稳定性试验 取批号为 201510 的供试品溶液，按“2.5.1.2”项下方法显色，分别于 0，5，10，15，20，25 min测定吸光度，RSD为1.98%( n =8)，结果表明，25 min 内样品稳定性良好。

2.5.1.7 重复性试验 取批号为 201510 的药材粉末 6 份，每份约 0.25 g，精密称定后按“2.5.1.3”项下方法制备，按“2.5.1.4”项下方法测定吸光度，RSD 为 1.36%( n =6)，结果表明重复性良好。2.5.1.8 加样回收率试验 取批号为 201510 的药材粉末 6 份，每份约 0.5 g，称重后加入芦丁对照品溶液 1.0 mL(质量浓度 2.043 mg·mL 1 )，按

“2.5.1.3”项下方法制备，按“2.5.1.4”项下方法测定吸光度，计算回收率。计算得平均回收率为97.60%，RSD 为 1.49%。2.5.2 总多糖测定 [10]2832.5.2.1 对照品溶液的制备精密称取无水葡萄糖对照品 50.08 mg，置于 50 mL 量瓶中，加水定容，摇匀，精密量取 2 mL 置 20 mL 量瓶中，加水定容，摇匀，得浓度为 0.100 1 mg·mL 1 的对照品溶液。

2.5.2.2 标准曲线的绘制 精密量取无水葡萄糖对照品溶液 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分别置10 mL 具塞试管中，各加水补至 10 mL，精密加入5%的苯酚溶液 1mL(临用新配)，摇匀，再精密加硫酸 5 mL，摇匀，置沸水浴中加热 20 min，取出，置冰浴中冷却 5 min，以相应试剂为空白，按中国药典 2015 年版 UV 法，在 490 nm 处测定吸收度，以浓度 C (mg·mL 1 )为横坐标，吸光度 A 为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为 A =0.010 12 C -0.017 49( r =0.996 8) ， 结 果 显 示 无 水 葡 萄 糖 在0.02001~0.100 05 mg·mL 1 内有良好线性关系。

2.5.2.3 供试品溶液的制备 取本品粉末约0.2 g，精密称定，加水 50 mL，称定质量，加热回流 2 h，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，滤过，取滤液 1 mL，置 50 mL 量瓶中，加水稀释至刻度，即得。

2.5.2.4 样品含量测定 精密量取供试品溶液1 mL，置 10 mL 具塞试管中，按“2.5.2.2”项下方法，自“精密加入 5%的苯酚溶液 1 mL 起”，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的含量，计算，即得。结果见表 1。

2.5.2.5 仪 器 精 密 度 试 验 取 浓 度 为0.040 02 mg·mL 1 无水葡萄糖对照品溶液，按“2.5.2.2”项下方法显色，在 490 nm 处重复测定吸光度 6 次，RSD 为 0.99%( n=6)，结果表明仪器精密度良好。

2.5.2.6 稳定性试验 取批号为 201510 的供试品溶液，按“2.5.2.2”项下方法显色，分别在 0，5，10，15，20，25 min测定吸光度，RSD为1.55%( n =8)，结果表明 25 min 内样品稳定性良好。

2.5.2.7 重复性试验 取批号为 201510 的药材粉末 6 份，每份约 0.1 g，精密称定后按“2.5.2.3”项下方法制备，按“2.5.2.4”项下方法测定吸光度，RSD 为 1.73%( n=6)，结果表明重复性良好。

2.5.2.8 加样回收率试验 取批号为 201510 的药材粉末 6 份，每份约 0.1 g，称重后加入无水葡萄糖对照品溶液1.0 mL(质量浓度为40.102 2 mg·mL 1 )，按“2.5.2.3”项下方法制备，按“2.5.2.4”项下方法测定吸光度，计算回收率。计算得无水葡萄糖平均回收率为 96.70%，RSD 为 1.35%。

2.5.3 总氨基酸测定 [12]

2.5.3.1 对照品溶液的制备 精密称取门冬氨酸对照品 51.84 mg，置于 50 mL 量瓶中，加水定容，摇匀，精密量取 3 mL 置 10 mL 量瓶中，加水定容，得浓度为 0.311 04 mg·mL 1 的对照品溶液。

2.5.3.2 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL，分别置 25 mL 比色管中，各加水至 10 mL，再分别加入 2 mL 磷酸盐缓冲液(pH 6.8)和 2 mL 2%茚三酮溶液，摇匀，置水浴中 30 min，取出，冰水中冷却至室温，放置5 min，用水稀释至 25 mL，摇匀，放置 15 min。以相应试剂为空白。按中国药典 2015 年版 UV 法，在 565 nm处测定吸光度。以浓度 C (mg·mL 1 )为横坐标，吸光度 A 为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程为 A =0.023 68 C -0.001 80( r =0.998 3)，结果显示门冬氨酸在 0.009 33~0.021 77 mg·mL 1 内有良好线性关系。

2.5.3.3 供试品溶液的制备 取本品粉末约0.2 g，精密称定，加水 50 mL，称定质量，加热回流 2 h，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

2.5.3.4 样品含量测定 精密量取供试品溶液5 mL，至 25 mL 比色管中，按“2.5.3.2”项下方法，自“加水至 10 mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含门冬氨酸的含量，计算，即得。结果见表 1。

2.5.3.5 仪 器 精 密 度 试 验 取 浓 度 为0.015 55 mg·mL 1 门 冬 氨 酸 对 照 品 溶 液 ， 按“2.5.3.2”项下方法显色，在 565 nm 处重复测定吸光度 6 次，RSD 为 1.90%( n=6)，结果表明仪器精密度良好。

2.5.3.6 稳定性试验 取批号为 201510 的供试品溶液，按“2.5.3.2”项下方法显色，分别在 0，5，10，15，20，25 min测定吸光度，RSD为1.45%( n =8)，结果表明 25 min 内样品稳定性良好。

2.5.3.7 重复性试验 取批号为 201510 的药材粉末 6 份，每份约 0.1 g，精密称定后按“2.5.3.3”项下方法制备，按“2.5.3.4”项下方法测定吸光度，RSD 为 1.73%( n =6)，结果表明重复性良好。

2.5.3.8 加样回收率试验 取批号为 201510 的药材粉末 6 份，每份约 0.1 g，称质量后加入门冬氨酸对照品溶液 1.0 mL(质量浓度为 1 mg·mL 1)，按“2.5.3.3”项下方法制备，按“2.5.3.4”项下方法测定吸光度，计算回收率。计算得门冬氨酸平均回收率为 97.13%，RSD 为 1.79%。

3 讨论

3.1 指标性成分的选择

现有研究表明 [13-14] ，三叶青中含有黄酮类、氨基酸类、萜类、强心苷类、甾体类、多糖类、有机酸类、挥发油和油脂以及丰富的微量元素。作为重要的抗癌物质，黄酮类物质是三叶青中最具有应用价值的有效成分，能抑制癌细胞的增殖，促进癌细胞的凋亡 [15] ；多糖类、氨基酸类物质是生物组成的重要物质，具有免疫调节、抗氧化、抗病毒及抗癌、美容等诸多作用 [16] 。故本研究选取能反映三叶青药物性质与质量情况的黄酮、氨基酸类、多糖类作为三叶青的指标性成分并测定其含量；选用芦丁作为对照品测定三叶青中总黄酮含量，选用无水葡萄糖作为对照品测定三叶青

中总多糖的含量，选用门冬氨酸作为对照品测定三叶青中总氨基酸含量。

3.2 重金属及有害元素

中国药典 2015 年版已收载品种如甘草、西洋参、黄芪、金银花 [10] 重金属及有害元素项下的限量 标 准 为 铅 不 得 过 5 mg·kg 1 、 镉 不 得 过

0.3 mg·kg 1 、砷不得过 2 mg·kg 1 、汞不得过

0.2 mg·kg 1 、铜不得过 20 mg·kg 1 。结果表明，12

批样品均在限度范围内。

3.3 限度标准制定的建议

依据测定结果，结合中国药典 2015 年版四部药材和饮片检定通则及国家药品标准(中药)研究制定技术要求，建议规定浙产三叶青的水分不得>13.0%；总灰分不得>8.0%；以干燥品计算醇溶性浸出物不得<7.5%；以干燥品计算含总黄酮以芦

丁(C 27 H 30 O 16 )计不得<0.37%、总多糖以无水葡萄糖

(C 30 H 48 O 3 )计不得<30.0%、总氨基酸以门冬氨酸

(C 30 H 48 O 3 )计不得<1.20%。

REFERENCES